中藥與天然藥物2015—2020 年研究亮點評述

中藥與天然藥物2015—2020 年研究亮點評述

作者：陳士林，孫奕，萬會花，張晗，趙 慶賀 （大陸中醫科學院中藥研究所，天津中醫藥大學部，成都中藥大學部）

來源：藥學學報 2020.11

編輯：陳皮

審核：小也

摘要：中藥與天然藥物在2015—2020 年取得多項突破性進展，屠呦呦青蒿素研究獲得諾貝爾獎促使大陸外掀起研究中藥與天然藥物的熱潮，“甘露寡糖二酸”、“桑枝總生物堿片”等原創藥物獲得新藥證書；多項研究成果入選年度“大陸十大醫學進展”，在Nature、Science、New England Journal of Medicine、Lancet 等國際頂級期刊發表了高水平的研究論文，本文梳理總結了這五年期間大陸外科學家在國際著名期刊發表中藥與天然藥物相關的亮點學術成果，并對其在化學、藥物資源、藥理、制劑、新藥開發等相關領域取得的重要進展進行了評述，以期追蹤和報道中藥與天然藥物領域發展的前沿和熱點，并通過對其的分析得出學科發展的啟示和展望，

關鍵詞：中藥；天然藥；天然產物；藥用植物；藥理；制劑

2015—2020 年是中藥和天然藥物研究與發展極其重要的年度，特別是屠呦呦青蒿素研究獲得2015 年度諾貝爾生理學或醫學獎，2016 年獲國家最高科學技術獎，2019 年獲得共和國勛章、聯合國教科文組織-赤道幾內亞國際生命科學研究獎，使全世界看到了中藥和天然藥物的巨大發展潛力。2019 年，屠呦呦研究員等5 位專家在New England Journal of Medicine 上提出了切實可行的應對“青蒿素抗藥性”的合理方案，隨后在Lancet 子刊再次闡述了方案的可行性及合理性[1]；同時闡明了青蒿素耐藥性的定義[2,3]；國際頂級醫學類教科書《牛津醫學教科書》（第6 版）章節：“傳統醫藥的范例：中醫藥”，2019 年已正式出版，近年來，青蒿素及其衍生物在抗寄生蟲、抗癌、抗炎、治療紅斑狼瘡等方面均具有良好的療效[4,5]；雙氫青蒿素對治療系統性紅斑狼瘡效果明顯，其適應癥臨床試驗已獲國家藥品監督管理局《藥物臨床試驗批件》。

在這5 年內，大陸外科學家在國際權威期刊上發表了大量中藥與天然藥物相關的學術論文，并在化學、藥物資源學、藥理、制劑、新藥開發等相關領域均取得重要成果。葉凱團隊完成的罌粟全基因組序列和西班牙埃斯皮納多大學部完成杏仁全基因組測序均發表于Science，張亮生團隊破解睡蓮基因組發表于Nature。英國約翰英納斯中心在長春花中基因組中發現了用于合成抗癌藥物長春花堿的最后幾個未知的基因，這項突破性研究發表于Science。加州大學部伯克利分校以半乳糖為原料，在釀酒酵母中完成了大麻素生物合成途徑的異源重構，實現了多種主要大麻素及其衍生物的生物全合成，該成果發表于Nature，戴均貴、黃璐琦等團隊成功在桑樹細胞培養物中發現自然界首個催化分子間[4+2]環加成反應的單功能酶MaDA，并建立了發現該酶目標識別策略，該成果在Nature Chemistry發表。美國加州大學部圣地亞哥分校在Nature 報道了類似血小板納米粒可顯著提高多西紫杉醇和萬古霉素治療心血管疾病和全身性細菌感染的能力，由大陸海洋大學部、大陸科學院上海藥物研究所和上海綠谷制藥聯合研發的阿爾茨海默癥治療新藥“甘露寡糖二酸”（GV-971）完成三期臨床試驗獲得新藥證書，并被評為年度大陸十大醫學科技新聞；由大陸醫學科學院、北京協和醫學院藥物研究所劉玉玲和申竹芳領銜研發用于治療2 型糖尿病的“桑枝總生物堿片”獲得國家藥監局批準上市，該藥是大陸首個降血糖原創天然藥物，也是大陸近十幾年來首個批準的中藥新藥。房靜遠團隊在柳葉刀子刊發表的中藥提取物黃連素減少結直腸癌復發的研究、陳士林團隊中草藥DNA 條形碼為中草藥建立基因身份證研究、尤啟東團隊主持的復雜結構天然產物抗腫瘤藥物的研發及產業化研究、葉文才、王廣基團隊中藥和天然藥物的三萜及其皂苷成分研究與應用、屠鵬飛團隊發表于PNAS 揭示傳統中藥蘇木的抗神經炎癥活性成分蘇木酮A 的直接作用靶點蛋白為IMPDH2 的研究等成果入選年度“大陸十大醫學進展”；中藥與天然藥物在抗擊covid19肺炎中還發揮了重要作用，本文評述了2015~2020 年大陸外科學家在中藥與天然藥物的若干領域所取得的重要研究進展，以期追蹤和報道中藥與天然藥物領域發展的前沿和熱點，

01

藥物化學研究

1.1 Asperflavipine A 等活性新骨架化合物成為天然產物研究亮點

自2015 年以來，不同新穎骨架結構的天然產物仍在不斷推陳出新，從結構類型上看，雜萜等萜類、聚酮類、生物堿類、以及PKS-NRPS 雜合型天然產物（圖2）成為了研究的亮點。這些天然產物大多具有良好的抗腫瘤、抗菌、抗炎等生物活性，新天然產物也因其特有的骨架特征帶來了巨大的研究潛力，具有代表性的新穎骨架天然產物及其生物活性如下：

1.1.1 源自植物和真菌的rhodomyrtusials 等雜萜類新骨架化合物

雜萜是化合物中部分結構來源于萜類生物合成的天然產物，因其新穎、多樣的結構骨架廣泛存在于微生物（包括真菌和放線菌）、海綿、以及桃金娘科、杜鵑花科、唇形科等植物和一些大型真菌中（如靈芝等）[6-8]。從一種土曲霉（Aspergillus terreus）中得到了2 個新型雜萜類次級代謝產物asperterpenes A 和B，這兩個化合物對BACE1 表現出優于臨床BACE1 抑制劑LY2811376 的抑制活性（IC50 值分別為78 和59 nmol·L-1）[9]，從桃金娘（Rhodomyrtus tomentosa）的枝葉提取物中發現含有乙酰膽堿酯酶抑制活性的物質，通過活性追蹤與高效的LC-UV 定向分離等方法，從該提取物中獲得3 個具有6/5/5/9/4 環系新穎骨架的間苯三酚雜萜類化合物rhodomyrtusials A 和B，它們具有較強的乙酰膽堿酯酶抑制活性（IC50 值為8.8 和6.0 μmol·L-1）[10]。從背柄紫靈芝（Ganoderma cochlear）中先后分離得到5 對對映體結構的雜萜二聚體cochlearoids A-E 和3 個具有6/6/5/6/6/6 新穎骨架的雜萜（±）-dispirocochlearoids A-C。T 型鈣通道（TTCC）抑制劑在治療多種神經系統疾病方面具有巨大潛力，cochlearoids A 和C 則能夠顯著地抑制TTCC的活性；而（±）-dispirocochlearoids A-C 為COX-2 的選擇性抑制劑，對小鼠的急性肺損傷還具有一定的抗炎活性[11,12]，

1.1.2 以苦木素和檸檬苦素衍生物等為代表的植物萜類新骨架化合物

從牛筋果（Harrisonia perforata）中分離得到化合物perforalactone A，它是首次從植物源分到的籠狀氧雜金剛烷骨架、且具有殺蟲作用的20S 新苦木素類化合物。Perforalactone A 對苜蓿蚜（Aphis medicaginis）表現出顯著的殺蟲活性，為煙堿受體（nAChR）拮抗劑（IC50 值為15.8 nmol·L-1）[13]，從灰毛漿果楝（Cipadessacinerascens）中分離到含有螺環結構的檸檬苦素類成分cipacinoid A，該化合物具有中等的蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）抑制活性[14]。從落羽杉（Taxodiumdistichum）中得到2 個獨特的以四環十八烷為核心的C30-萜烯taxodisones A 和B，仿生物合成表明兩個化合物源自二萜和單萜，而非角鯊烯或氧化角鯊烯[15]，Pierisketolide A 是從美麗馬醉木（ Pieris formosa ） 根部得到的一個A-homo-B-nor-ent-kauane 骨架的二萜，在10 mg·kg-1 的劑量下具有鎮痛作用，抑制率達到45%[16]，從巴豆屬巴豆腈（Croton kongensis）和曼哥龍巴豆（Crotonmangelong）中分別得到新骨架二萜crokonoid A 和大環二萜的對映異構體（+）mangelonoids A 和（−）B，其中crokonoid A 對A549 細胞具有較強的細胞毒性（IC50 值為(1.24±0.56) μmol·L-1），而mangelonoid A 則具有抑制NF-κB 的作用（IC50 值為(7.27±1.30) μmol·L-1）[17,18]，Artemisian B 是從艾蒿（Artemisia argyi）中分離得到的1,10-4, 5-二-斷愈創木內酯與愈創木內酯二烯經[4+2]Diels-Alder 加成形成的聚合體，它可誘導細胞凋亡并引起細胞G2/M 期停止，從而對抗乳腺癌細胞MDA-MB-468 的增殖（IC50 值為3.21 μmol·L-1）[19]。

1.1.3 Neuamycin B 等聚酮類新骨架化合物

聚酮類化合物是由植物和微生物通過聚酮合酶的作用，將低級羧酸進行一系列醇醛縮合反應而產生的一類天然產物，聚酮類化合物的結構骨架多樣，其顯著的生物活性是新藥研發的巨大寶庫。從一種等足類動物共生真菌中分離得到一個具有成骨作用的新大環雙內酯類次級代謝產物acaulide，該化合物在0.4 和2.0 μmol·L-1 濃度下對脫氫皮質醇誘導的骨質疏松斑馬魚模型具有抗骨質疏松的作用[20]，從鏈霉菌屬QL37 中得到1 個具有獨特七環結構的芳香族聚酮類化合物lugdunomycin，通過代謝組質譜分子網路分析，解析出其他24 種重排或者未重排的化合物，并且其中的11 個化合物為未見報道的新化合物[21]。從海洋放線菌小單孢菌（Micromonospora）中分離到一個28 元大環內酯類化合物neuamycin B，是膠質母細胞瘤強抑制劑（LD50 值為6.4×10-8 μmol·L-1），研究者利用基因組序列資訊與NMR 分析的結合方法確定了該化合物的立體構型[22]；另一個來自Burkholderia gladioli 的大環內酯類次級代謝產物gladiolin，具有非常強的抗結核菌Mycobacteium tuberculosis 的作用；Gladiolin 能夠抑制一種有效的結核分枝桿菌的靶點RNA 聚合酶，并對幾種臨床常見耐藥結核分枝桿菌顯示出良好的活性（MIC 值為0.4~2.3 μg·mL-1），具有較好的開發前景[23]，

1.1.4 Nannocystin A 等PKS-NRPS 型新骨架化合物

研究人員發現了很多聚合酮酶-非核糖體多肽合成酶（PKS-NRPS）催化形成的雜合型化合物，它們主要存在于植物、海洋沉積物與海藻、真菌等微生物中。PKS 和NRPS 能夠催化不同來源的聚酮骨架和氨基酸而生成結構多樣且生物活性顯著的雜合型化合物，從一株罕見的黏細菌Nannocystis sp.中發現了一個新型的21 元大環骨架化合物nannocystin A，它是由三肽和帶有環氧酰胺基團的聚酮組成，利用NMR 光譜、分子動力學計算、化學降解和X 射線晶體學的方法確定了分子內9 個立體中心的相對和絕對構型，研究者發現nannocystin A 可以通過早期誘導細胞凋亡來抑制細胞增殖，結構中的環氧部分對于該活性起到了重要作用[24]，基于基因組挖掘技術，采用熒光疊氮化物探針的方法從藍細菌Moorea producens ASI16Jul14-2中發現了3 種炔化脂肽及其溴化類似物vatiamides A-F。這些化合物源自同一個非共線PKS/NRPS 系統，其形成的方式為微生物系統中的分子多樣性提供了一種新型的組合能力[25]，從一株真菌Hymenochaete rubiginosa 來源的鏈霉菌中分離得到一個新穎的多環肽類化合物tryptorubin A，全基因組測序結果闡明了與該線性六肽主鏈相關的一對生物合成基因[26]。

1.1.5 以單萜喹啉生物堿和吲哚生物堿、二萜生物堿為代表的植物生物堿類新骨架化合物

Suadimins A 為首次報道的源自山橙（Melodinus suaveolens）的單萜喹啉型生物堿二聚體，它具有顯著的抗結核分枝桿菌H37Rv 的活性（MIC90 值為6.76 μmol·L-1）[27]，從尼泊爾虎皮楠（Daphniphyllum himalense）中分離得到化合物himalensine B，該化合物對兩種激酶PTP1B 和IKK-β 具有一定的抑制活性（抑制率分別為31%和29%）[28]。從Melodinus cochichinensis 中得到的melocochines A 和B 是一對罕見的單萜吲哚型生物堿差向異構體，二者可增強溶酶體的生物起源，對溶酶體探針（LysoTracker）的染色強度分別為139.7%和119.0%[29]。Phlegmadine A 是從Phlegmariurus phlegmaria 分離到的一種新型含有獨特環丁烷結構的石蒜堿型生物堿[30]，從附子（Aconitum carmichaelii）的水提取物中分離鑒定出了3 個硫代C-20 二萜生物堿類化合物，分別是具有重排的atisane 烷型骨架的aconicatisulfonines A 和B，以及aconicarmisulfonine A；前者對乙酸引起的小鼠扭傷具有顯著的鎮痛作用[31,32]。此外，從銀葉巴豆（Croton cascarilloides）中也分離鑒定了一種二萜生物堿類新骨架化合物cascarinoid A[33]。

1.1.6 源自真菌的asperflavipine A 等細胞松弛素類新骨架化合物

細胞松弛素是一類結構新穎且生物活性廣泛的真菌次級代謝產物，近5 年發現了一些具有特殊結構特征的化合物，從黃柄曲霉（Aspergillus flavipes）中分離鑒定了一個具有5/6/11/5/6/5/6/5/6/5/5/11/6/5 十四元環系的細胞松弛素雜四聚體（asperflavipine A）和一個5/6/11/5/5/6/5/11/6/5 細胞松弛素asperchalasine A[34,35]。Asperflavipine A 包含了2 個細胞松弛素和2 個epicoccine 結構單元，是首個細胞松弛素雜四聚體，它的發現揭示了細胞松弛素研究的新領域。Asperflavipine A 具有中等的細胞毒性，能夠通過激活caspase-3 以及降低PARP 的活性誘導包括Jurkat、NB4、HL60等腫瘤細胞的凋亡，此外，從馬鈴薯內生炭角菌Xylaria cf. curta 中分離到了結構新穎的細胞松弛素curtachalasins A-E 和一個鹵代六環細胞松弛素xylarichalasinA，其中curtachalasin C 能逆轉白色念珠菌抗氟康唑的抗藥性[36-38]，

1.1.7 其他類型新骨架化合物

從中藥蛇床子（Cnidium monnieri）的果實中分離到一對外消旋二聚體（±）cnidimonin A，它是由香豆素二聚體構成，含有不同的結構單元（如黃酮醇、苯并呋喃和色酮），該化合物顯示出比其相應的旋光對映異構體更強的抗病毒HSV-1 的作用（IC50 值為1.23 μmol·L-1）[39]，從飛龍掌血（Toddalia asiatica）中得到2 對低聚香豆素對映體spirotriscoumaris A 和B，二者均具有螺二烯酮駢合倍半萜的獨特骨架，外消旋混合物具有抗流感病毒H2N2的作用，其活性較相應的旋光異構體強3～6 倍（IC50 值分別為3.13 和2.87μmol·L-1）[40]。從蜜茱萸（Melicope patulinervia）的葉子中分離到3 對木脂素-間苯三酚雜合物的對映體（±）-melipatulinones A-C，這些化合物均具有抑制胰脂肪酶的作用[41]。

1.2 結合次生代謝組學與基因組學，以及活性天然產物作用靶標的化學蛋白質組學，推動先導化合物研究

次級代謝組學是對植物和微生物體內的次級代謝產物進行定性和定量的分析方法，已成為發現潛在復雜植物和微生物次級代謝產物譜的重要技術手段（圖3），基于LC-HR-MS 和NMR 等分析技術的次級代謝組學應用于代謝產物之間的化學篩選和快速對比，能夠高效地揭示一系列次級代謝組間的成分差異，并定位各個實驗組數據中的差異化合物[42-44]。

LC-HR-MS 較常用于次級代謝組學分析，目前有一些資料庫可用于搜索鑒定已知物并預測新天然產物（表1）。其中，GNPS Web 平臺能夠針對微生物次級代謝產物的高分辨率質譜數據對天然產物的結構進行鑒定，并結合分子式的歸屬把MS/MS 裂解譜圖與資料庫進行比較，對不同類型的化合物分組，最終將光譜轉換成分子網路模式（molecular network），在LC-MS 代謝物譜分析中，平臺可利用數據采集DDA 來運行LC-MS/MS[45]，Floros 等[46]通過GNPS 平臺對1 000 種隨機選擇的微生物次級代謝產物組的LC-MS/MS 數據進行了評估，并應用主成分分析（PCA）方法找到了不同的天然產物簇，預測了這些菌株的生物合成潛力；同時運用代謝組學的方法找出了76 個分子家族來優選具有較好代謝水平的菌株，再通過LC-HR-MS 給出的高分辨分子質量、分子式、MS/MS 裂解碎片等資訊與資料庫的相應數據進行比對，從而推測未知分子離子峰為新天然產物，

運用次級代謝組LC-HR-MS 實驗可以較全面地完成新天然產物的鑒定和已知化合物的去重工作[47]，Crusemann 等[48]利用LC-MS/MS 方法建立了146 種海洋鹽孢菌和鏈霉菌株的次級代謝產物圖譜，該研究根據培養基、培養條件以及提取方法的不同對細菌次級代謝產物的產量進行綜合評價，從大約180 萬個MS/MS 譜構建的分子網路中鑒定出15 個分子家族的天然產物及其類似物，提供了一種基于代謝物組成不同來比較菌株的方法。利用一種基于NMR 分析的小分子精確識別技術（SMART 2.0）能夠進行天然產物提取物的分析，這樣可提高發現和表征提取物中新天然產物的效率，Reher 等[49]將SMART 2.0 應用于絲狀藍細菌的提取物中，基于NMR SMART 2.0 和分子網路的MS/MS 分析，對具有細胞毒性的化合物進行優先排序，再根據分析結果快速分離鑒定出了一種新型的大環內酯類成分，

基因組挖掘技術可結合強大的分析系統來檢測次級代謝產物在復雜代謝體系中潛在的微妙變化，次級代謝組學對于以基因組研究為基礎的新型次級代謝物的發現起到了重要作用，近年來，對于微生物次級代謝組學與基因組聯系的研究越來越多。由于高通量非靶向代謝組學能夠產生大量的數據，而這些數據集的開發和詮釋通常需要生物資訊學工具，因而，研究微生物完整的代謝潛力也需要基于基因組的方法[50]，采用以抗性基因為導向的基因組挖掘技術，成功地發現了一種新型天然產物除草劑aspterric acid (AA)，它能夠利用靶向植物支鏈氨基酸合成途徑（BCAA）中的二羥酸脫水酶（DHAD）來抑制植物的生長，該研究首次解析了DHAD 全酶的結構及其與AA 的結合機制，并揭示了新型除草劑產生效能的分子機制。該研究為挖掘基因組尋找天然產物提供了新的方法和啟示[51]，從昆蟲微生物群中進行大規模的鏈霉菌分離，再利用基因組學和代謝組學分析、以及體內感染模型測定等策略，評估了昆蟲鏈霉菌的獨特進化譜系，并篩選出了一種對多藥耐藥真菌病原體有效的新抗生素cyphomycin[52]。

近年來，以親和性蛋白質組學分析方法為主導的化學蛋白質組學，已成為識別天然產物作用靶標較成熟的方法。Ismail 等[53]開發了一套基于青蒿素活性的蛋白質譜分析探針，通過定義青蒿素的蛋白質組，在糖酵解和血紅蛋白降解、抗氧化防御、蛋白質合成途徑中顯示出烷基化靶標，以用于原位鑒定瘧原蟲蛋白質藥物靶標，Li 等[54]發現青蒿素能夠結合gephyrin 蛋白以激活GABAA 受體，并通過增強GABAA 信號驅動體內胰腺α 細胞向功能性β 樣細胞轉化，可能具有治療糖尿病的潛力，Yi 等[55]基于親和性蛋白組學化學探針將肌動蛋白鑒定為小檗堿的靶標，并發現小檗堿在體外生化水平和細胞水平上均能夠顯著地調節肌動蛋白生成，

1.3 DI-MS、CMC 等技術改良及其在中藥分析領域的應用與新藥開發

Direct infusion-mass spectrometry（DI-MS）可作為代謝組學的分析工具，Xu等[56]提出了一種DI-3D-MS 新技術，對傘形科的幾種中藥進行了化學組的比較，并建立了資料庫，總結了傘形科植物中各類型香豆素分布。細胞膜色譜法（CMC）是從復雜系統中篩選作用于靶細胞膜潛在活性成分的理想方法。Ding 等[57]開發了一種新型的（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷（APTES）修飾的硅膠，改善了CMC法使細胞膜被固定在硅膠表面上而不易脫落。作者以篩選丹參中的潛在活性成分進行考察，建立了一種新型的APTES 修飾的HepG2 癌癥干細胞膜色譜（CSCMC），并應用于二維色譜系統中，發現丹參酮IIA、隱丹參酮和二氫丹參酮I 保留在該模型上，并通過細胞增殖和凋亡試驗證明對HepG2 癌癥干細胞有效性，Chen 等[58]開發出一個表面等離子體共振（SPR）生物傳感器的活性成分識別系統（SPR-AIRS），并應用于篩選信號轉導子和轉錄激活因子3（STAT3）配體。該方法能夠從復雜中藥基質中識別活性STAT3 配體的天然產物，

采用LC-UV 或LC-MS/MS 分析結合DNA 條形碼技術，Song 等[59]對3 種藥用甘草（G. uralensis, G. glabra, G. inflata）進行了最大規模的藥用植物靶向次級代謝組學分析，對甘草中151 個活性成分進行了定量分析，包括17 種黃酮苷、24 種皂苷和110 種游離酚類化合物。該報道涉及到有關甘草的生物合成、遺傳、質量控制等多方面研究，Qiu 等[60]利用UPLC-LTQ-Obitrap-MS 分析并結合NMR驗證質譜解析結構資訊，對人參莖葉中的總人參皂苷進行了全面的分析，共鑒定了646 種人參皂苷，包括427 種未分離到的成分，優于傳統方法。Shi 等[61]開發出一種基于內源多重碰撞中性損失過濾（IMC-NLF）的非靶向代謝組學分析方法，將其應用于鑒定和定量人參中的101 個丙二酰基人參皂苷類成分，包括人參中69 個、西洋參52 個、三七中44 個；同時統計了45 批人參樣品中81 個丙二酰基人參皂苷的成分變化。采用中性丟失/前體離子掃描技術等質譜分析方法，Qiao 等[62]對中藥姜黃的成分進行了全面的系統分析，從中發現了846 種姜黃素衍生物，包括許多潛在的新型化合物。由華中科技大學部同濟藥學院、沈陽藥科大學部、軍事醫學研究院國家應急防控藥物工程技術研究中心組成聯合攻關小組，系統性分析了新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）基因編碼的蛋白作為主要或潛在的藥物治療靶點，并通過計算機虛擬篩選方法發現了一系列具有抗病毒、抗菌和抗炎作用等的臨床藥物和天然產物對不同的靶蛋白表現出很高的親和力，為新型冠病毒感染性疾病（COVID-4）的治療提供新的可能。文章公布共享所有構建的covid19病毒靶點結構模型和篩選得到的候選藥物，以加速大陸外同行開發治療covid19肺炎的藥物，在國際上引起了較大的反響[63]。由大陸醫學科學院、北京協和醫學院藥物研究所研發用于治療2 型糖尿病的“桑枝總生物堿片”獲得國家藥監局批準上市，該藥是大陸首個降血糖原創天然藥物，也是大陸近十幾年來首個批準的中藥新藥，桑枝總生物堿具有靶點清晰、物質基礎明確和降糖作用顯著等特點，優于單純糖苷酶抑制劑，具有天然藥物獨特的多重藥理作用優勢，

02

藥物資源研究

2.1 罌粟、人參、長春花、菊花、雷公藤、丹參等多種藥用植物基因組測序推動復雜天然產物生物合成途徑解析

大陸學者提出“本草基因組學”計劃，2015 年在Science 專刊發表“本草基因組學解析傳統中醫藥”，為傳統中藥研究與和現代生命科學結合提出了新的構架[64]，隨著基因組測序及分析技術的進步，近5 年來藥物基原物種的基因組學研究發展迅速，越來越多的藥用植物進行了全基因組測序，為復雜天然產物生物合成途徑解析提供了大量的基因資訊（圖4）。葉凱研究組利用多種前沿基因組測序技術、復雜數學模型和基因深度挖掘等分析方法，首次完成了罌粟（Papaversomniferum）全基因組測序，組裝獲得11 條染色體；并首次發現罌粟合成嗎啡（morphinan）等芐基異喹啉生物堿的15 個基因在11 號染色體上形成超級基因簇，該基因簇在根、莖部特異表達且共表達，同源分析表明細胞色素P450（CYP450）加氧酶基因與還原酶基因融合形成“STORR”基因模塊，該基因模塊對嗎啡的生物合成起決定性作用[65]。大陸中醫科學院中藥研究所李秋實等進一步利用Hi-C 技術改進罌粟基因組組裝結果，使之前組裝到scaffold 上的基因重新組裝到染色體上，其中包括35 個芐基異喹啉生物堿合成相關基因，對芐基異喹啉生物堿合成關鍵基因的拷貝數變異分析發現，那可丁（noscapine）的產生與11 個基因的缺失有關，帝巴因6-O-去甲基酶（thebaine 6-O-demethylase,T6ODM）基因簇的缺失可導致帝巴因（thebaine）合成增加，嗎啡合成減少[65]。

陳士林、徐江團隊突破人參（Panax ginseng）基因組重復序列較多（超過62%）的障礙，成功破譯人參的全基因組序列，共預測42 006 個編碼蛋白，與13 種植物進行進化分析，發現1 648 個基因為人參特有的，鑒定出31 個基因參與甲羥戊酸途徑、225 個UDP-糖基轉移酶（UGT），參與人參皂苷的合成和修飾[66]，韓國漢城國立大學部進一步完善人參的基因組圖譜，并且利用人參基因組和轉錄組數據構建了人參基因組資料庫[67]，楊生超研究組和董揚研究組以及高立志研究組分別完成三七（P notoginseng）基因組測序，以背靠背的形式發表于Molecular Plant[68,69]，楊生超研究組和董揚研究組預測到36 790 個編碼蛋白的基因，發現了大量三七皂苷生物合成的候選基因，包括萜烯合酶（TPS）和UGT等[68]，高立志研究組發現三七在歷史上發生過多倍化事件，導致三萜皂苷生物合成相關基因家族大量復制與擴增，形成了眾多的基因簇，決定了三七皂苷的合成；此外，他們發現與三七皂苷生物合成相關的多數基因主要在花和葉里表達，推測三七皂苷主要在花和葉片中合成，然后再轉運并儲存在根部，這個發現顛覆了一直認為的三七皂苷在根里合成的觀點[69]。人參和三七兩種人參屬植物的全基因組測序，對解析人參皂苷代謝通路以及指導三七、人參和西洋參的育種、種植具有重要的意義。

Kellner 等[70]完成了馬達加斯加長春花（Catharanthus roseus）的基因組組裝，為解析長春花堿生物合成途徑提供全面的基因資源，鑒定出3 個長春花堿生物合成途徑中共表達基因簇，該研究發現長春花堿生物合成具有前體和中間體協同合成的特征，在馬達加斯加長春花基因組研究基礎上，Caputi 等[65]鑒定出植物合成長春花堿（ catharanthine ） 所必需的最后兩個酶， 前二酮乙酸酯合成酶（precondylocarpine acetate synthase, PAS）和dihydroprecondylocarpine 合成酶（dihydroprecondylocarpine synthase, DPAS），闡明由花冠木堿生成水甘草堿（tabersonine）和長春花堿的代謝路徑，其中dihydroprecondylocarpine 分子極其不穩定，導致DPAS 酶極難被發現，因此，長春花堿生物合成途徑解析成為困擾全世界生物科學家60 多年的難題，這項突破性研究成果使得長春花堿的異源生物合成成為可能，

雷公藤（Tripterygium wilfordii）由于生長緩慢且活性物質含量極低，因此迫切需要解析雷公藤甲素和雷公藤紅素的生物合成途徑。高偉研究組聯合黃璐琦研究組在雷公藤基因組測序、轉錄組測序以及代謝途徑解析方面取得較大進展。他們揭示了雷公藤甲素從線性牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（ geranylgeranylpyrophosphat，GGPP）環化成松香烷型二萜烯中間體miltiradiene 的生物過程。他們通過底物飼喂實驗證實松香烷型二萜烯（miltiradiene）為合成雷公藤甲素的二萜烯中間體化合物，進一步篩選到萜類合酶基因TwTPS7v2 和TwTPS9v2，可催化GGPP 形成二磷酸鈷醛（CPP ）， TwTPS7v2 可進一步催化CPP 形成miltiradiene[71]。2019 年，他們又鑒定雷公藤紅素生物合成途徑中編碼2,3-氧化鯊烯環化酶（OSC）的關鍵基因，并構建人工酵母細胞合成雷公藤紅素的前體木栓酮。他們在雷公藤轉錄組數據中克隆到3 個TwOSCs，在酵母中異源表達證明TwOSC1 和TwOSC3 是催化木栓酮合成的候選基因，他們還構建了過表達三萜合成上游基因以及TwOSC1 的人工酵母細胞，通過體系優化，木栓酮產量最高達到37.07 mg·L-1 [72]。他們首次成功構建了高質量的雷公藤基因組圖譜，是衛矛目植物的第一個基因組。通過基因組進化分析，證明雷公藤發生了一次全基因組三倍化復制事件，導致雷公藤甲素生物合成途徑基因的拷貝數增加，他們進一步通過基因組、轉錄組和代謝組等多組學聯合分析手段，成功篩選并鑒定細胞色素P450（CYP728B70）基因，這是CYP728 家族第一個被明確功能的基因，可催化miltiradiene 發生三步氧化生成雷公藤甲素中間體dehydroabietic acid[73]。

黃璐琦團隊完成天麻的全基因組測序（Gastrodia elata），繪制了第一個完全依賴于菌根異養植物的高質量基因組圖譜。基因組分析發現天麻經歷了廣泛的基因缺失，其中3 586 個基因家族發生了收縮，丟失了2 961 個基因，可能是其適應完全異養生活方式的結果。由于沒有光合作用的能力，天麻完全依靠共生菌（蜜環菌）提供營養。研究團隊發現獨角金內酯是天麻與蜜環菌共生關系建立的重要信號，天麻中獨角金內酯生物合成和運輸關鍵基因（類胡蘿卜素裂解酶基因、ABC 轉運蛋白基因）、鈣調素依賴性蛋白激酶DMI3 基因的數量都增加了，這些基因的擴增有助于天麻和蜜環菌的共生，此外，精氨酸生物合成以及尿素代謝的關鍵基因（谷氨酸N-乙酰轉移酶基因、尿素酶基因）的數量也都增加，這些基因在天麻氮素轉運中發揮了關鍵的作用[74]，

昆明理工大學部及其合作者利用二代Illumina 測序技術和三代PacBio 測序技術相結合，成功完成了高度雜合的丹參（Salvia miltiorrhiza）基因組組裝，進一步分析預測了丹參基因組中的34 598 個蛋白質編碼基因和1 644 個獨特的基因家族[75]。大陸中醫科學院中藥研究所對紫花和白花丹參（S. miltiorrhiza）的基因組進行了測定和分析，系統進化分析表明丹參中顯著擴張的基因家族主要參與二苯乙烯、二芳基庚烷、姜辣素的生物合成（KO00945）、萜類生物合成（KO00902）和甾體生物合成（KO00100），這些基因家族的擴張可能與丹酚酸和丹參酮的合成相關，在基因組中鑒定出82 個萜類合酶（terpene synthase, TPS）基因和437個CYP450 基因，并鑒定出4 個萜類合酶/CYP450 基因簇[76]。

宋馳等[77]利用納米孔（nano-pore）測序技術突破復雜高等植物基因組測序，首次完成了藥用菊花野菊的全基因組測序，同時還完成重要的藥用菊花品種——杭白菊的全長轉錄組遺傳資訊發掘，該研究對于闡釋被子植物的進化尤其是菊科植物多樣性具有極其重大的科學意義，同時本項研究將極大地促進菊花藥效成分、香氣、花型及花色相關基因的深入挖掘和分子育種模式下的藥用菊花品種選育，

同時，大陸外科學家還對博落回（Macleaya cordata）[78]、烏拉爾甘草（Glycyrrhiza uralensis）[79]、黃芩（Scutellaria baicalensis）[80]、黃花蒿（Artemisiaannua）[81]、穿心蓮（Andrographis paniculate）[82]、梔子（Gardenia jasminoides）等多種藥用植物進行基因組測序，對解析芐基異喹啉類生物堿、甘草次酸、漢黃芩素、青蒿素、穿心蓮內酯、西紅花苷等復雜天然產物的生物合成途徑具有重要意義（表2）[65-70, 73-96]，

2.2 大麻素、燈盞花素、人參皂苷等天然產物的合成生物學研究為天然產物的工廠化生產奠定基礎

據統計，現今大約30%的化學藥物都來自于天然產物。隨著天然產物新的藥理活性不斷被發現，導致對大麻素、人參皂苷、燈盞花素等天然產物的需求量持續增加，因此，日益嚴重的藥材資源短缺已成為制約中藥和天然藥發展的短板，合成生物學的發展成為解決藥材資源短缺問題的有效途徑，

隨著高純度大麻二酚（cannabidiol，CBD）液體制劑Epidiolex®藥物在美國上市，并且成為治療小兒癲癇的“孤兒藥”，大麻素的市場需求量迅速增加，Luo等[97]以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為底盤細胞，以半乳糖為原料，通過設計天然的甲羥戊酸途徑來提供高通量的焦磷酸香葉酯，同時引入一條高效的乙酰-輔酶A 生物合成途徑，導入大麻四酮合成酶（CsTKS）10 和橄欖酸環化酶（CsOAC）將乙酰輔酶A 和丙二酰輔酶A 合成大麻素生物合成途徑的初始中間體橄欖酸，再引入新的橄欖酸酯香葉酰轉移酶（GOT），催化橄欖酸和焦磷酸香葉酯生產大麻素的直接前體大麻酚酸，同時導入相應的大麻素合成酶基因，分別合成四氫大麻酚（tetrahydrocannabinol, THC）或大麻二酚。該團隊還通過給工程菌株飼喂不同的脂肪酸，對受體結合親和力和效力進行修飾等方法優化工程酵母中大麻素生物合成效率，使大麻二酚的產量達到3 mg·L-1 以上。大麻素合成生物學研究的突破為大麻素的工廠化生物合成奠定了堅實基礎。

燈盞乙素（scutellarin）是燈盞細辛（Erigeron breviscapus）的黃酮提取物，越來越多地用于治療心腦血管疾病，而燈盞細辛的植物供應已不能滿足日益增長的市場需求。利用合成生物學合成燈盞花素是解決燈盞細辛資源緊張的有效手段。Liu 等[98]從燈盞細辛基因組中鑒定出燈盞花素生物合成途徑中的兩個關鍵酶，分別為黃酮苷7-O-葡萄糖醛酸基轉移酶和黃酮-6-羥化酶，然后將兩個關鍵酶整合到釀酒酵母細胞中，通過飼喂葡萄糖，由酵母工程菌株合成燈盞花素。經過補料分批發酵等方法優化，燈盞花素主要活性成分燈盞乙素和芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸的產量分別達到108 和185 mg·L-1。該研究不僅為燈盞乙素提供了新的來源，而且為天然產物代謝工程研究提供了一個整合基因組學和合成生物學的研究范例。

人參皂苷是人參、西洋參以及三七等五加科人參屬植物中主要活性物質，主要為原人參二醇（PPD）和原人參三醇（PPT）的糖基化產物，具有抗腫瘤、提高免疫力等藥理活性，但植物中人參皂苷含量較低，遠遠不能滿足市場需求，因此，人參皂苷的合成生物學研究成為研究熱點之一，Wei 等[99]從人參中分離了4個新的糖基轉移酶基因（UGT），其中，UGTPg100 可特異性地催化PPT 的C6位糖基化合成人參皂苷Rh1。

通過將UGTPg1 或UGTPg100 轉入生產PPT 的酵母底盤細胞中，構建生產人參皂苷F1 和Rh1 的工程酵母，合成人參皂苷F1 和人參皂苷Rh1 的產量最高分別為42.1 和92.8 mg·L-1，Wang 等[100]在人參中克隆并鑒定了兩個糖基轉移酶，UGTPg45 可以催化PPD 的C3 位糖基化生成人參皂苷Rh2，UGTPg29 可催化Rh2 的糖配基進一步糖基化。將兩個糖基轉移酶整合到生產PPD 的酵母底盤細胞中，建立以葡萄糖為原料生產Rh2 和Rg3 的酵母細胞工廠，Rh2 和Rg3 的最高產量分別為16.9 和49.8 mg·L-1；UGTPg29 的催化效率是UGTPg45 的2 500 多倍，推測UGTPg45 有可能是合成Rh2 和Rg3 的限速酶，Zhuang 等[101]通過對糖基轉移酶UGT51 進行改造，將突變后的糖基轉移酶導入釀酒酵母，使Rh2 的產量提高到300 mg·L-1，Wang 等[102]進一步設計優化PPD 底盤細胞，定向進化野生型糖基轉移酶UGTPg45，最終使Rh2 的產量達到2.2 g·L-1。Wang 等[103]在三七中鑒定出5 種糖基轉移酶，其中包括一種新的催化人參皂苷R1 合成的木糖轉移酶，將糖基轉移酶Pn3-29 轉入生產PPD 的酵母底盤細胞中，建立人參皂苷K 產量大于1 g·L-1 的酵母細胞工廠。各種人參皂苷的合成生物學研究可以作為創造重要天然產物替代來源的基礎，從而保護自然植物資源。

通過在煙草中表達紫杉烯合成酶、紫杉烯-5α-羥化酶、細胞色素p450 還原酶，并成功獲得了紫杉醇中間體。利用葉綠體代謝工程策略，獲得了紫杉醇的中間體紫杉烯和5α-羥基紫杉烯（產量分別為56.6 和1.3 μg·g-1 FW）[104]。采用轉錄組學和蛋白質組學相結合的方法，Royer 等[105]對中藥金銀花中的胡蘿卜素類成分rhodoxanthin 進行了生物合成途徑的研究，該研究鑒定了β-胡蘿卜素羥化酶家族酶LHRS，并證明LHRS 能夠羥基化β-胡蘿卜素并可催化rhodoxanthin 生物合成所需的獨特的酮基化、去飽和和雙鍵重排。Oyarce 等[106]通過擬南芥異源表達姜黃生成姜黃素的酶diketide-CoA 合成酶（DCS）和curcumin 合成酶2（CURS2），使姜黃素摻入木質化細胞壁中產生姜黃素，Zhang等[107]首次鑒定了茶葉中嘌呤生物堿9-N-甲基轉移酶-CkTcS，并闡明了晶體結構，證明了影響該酶活性的關鍵氨基酸位點。

通過轉錄組數據分析及活性篩選，Wang 等[108]從黃芩（Scutellaria baicalensis）中挖掘得到了一條具有寬泛的底物雜泛性以及糖基供體雜泛性的黃酮類3-O-糖基轉移酶UGT78B4，并通過同源模建及分子對接對糖供體雜泛性的機制進行了探討。He 等[109]從金蓮花（Trollius chinensis）中發現了第一條黃酮類8-C-糖基轉移酶TcCGT1，并報道了其晶體結構，這也是第一個植物CGT 結構，該研究中作者發現底物可通過自發脫質子進行糖基化反應的發生，同時基于晶體結構及分子對接，對C-糖基化機制及O-糖基化機制進行了研究，并實現了將TcCGT1 由CGT 功能向OGT 功能的改造，此外，He 等[110]從烏拉爾甘草（Glycyrrhiza uralensis）中挖掘得到了第一條五環三萜類化合物的30/29-O-糖基轉移酶UGT73F17，該酶具有很強的位點選擇性，能夠利用多種糖基供體，特異性催化五環三萜的C-30/C-29 位的羧基，使其發生糖基化，Zhang 等[111]從光果甘草（G. glabra）中篩選得到了一條以弗洛丙酮為最佳催化結構單元的雙C-糖基轉移酶GgCGT，GgCGT 是第一個具有晶體結構的雙C-糖基轉移酶。在該項研究中，作者通過結構分析、定點突變等方式對糖基供體選擇性機制以及雙C-糖基化機制進行了研究。

Gao 等[112]基于生物合成中間體分子探針技術，利用分子探針從桑樹（Morusalba）中挖掘得到了自然界中首個催化分子間[4+2]環加成反應的DA 酶MaDA，MaDA 可高效催化多種底物并生成相應的D-A 類型化合物，具有一定的底物雜泛性，DFT 計算及MaDA 晶體結構解析則進一步揭示了其催化分子間DA 反應的分子機制，微生物中的天然產物生物合成酶同樣引起了研究者的廣泛關注，Chen 等[113]從土曲霉（Aspergillus terreus）中發掘的異戊烯基轉移酶AtaPT 可催化芳香類化合物發生異戊烯基化，其具有極為寬泛的底物雜泛性以及異戊烯基供體雜泛性。作者通過對AtaPT 晶體結構的解析及定點突變等方式對其雜泛性機制進行了研究，其中部分突變體成功改變了其底物雜泛性，Zhang 等[114]從海洋放線菌中發現的具有抗幽門螺旋桿菌活性的聚酮化合物streptoseomycin 的結構出發，結合基因敲除、體內外酶催化反應、DFT 計算等技術，發現了自然界首例催化[6+4]環加成反應的酶，并基于晶體結構分析及定點突變實驗，對其環加成的催化機制進行了深入探索。Chen 等[115]對于從芒果Mangifera indica 中發現的C-糖基轉移酶MiCGT 開展了深入研究。MiCGT 以間苯二酚為催化C-糖基化反應的最小結構單元，同時能夠利用UDP-glucose 與UDP-xylose 為糖供體生成相應的碳苷產物。此外作者發現碳苷產物對于SGLT2 具有良好的抑制活性，表明CGT 在活性化合物的合成中可起到重要作用。

除上述天然產物的合成生物學研究取得重大突破外，有關原伊魯烯、β-香樹脂醇、甘草次酸、番茄紅素、文朵靈、異胡豆苷、天麻素、大黃素等復雜天然產物的合成生物學研究也取得較大進展，為中藥事業的健康有序發展提供物質基礎（表3）[97-101, 103, 116-124]。

2.3 大麻、杏仁等藥用植物的群體遺傳學研究

促進選種育種研究除了利用合成生物學合成重要天然產物，還可在群體遺傳學、基因組學研究和生物合成途徑解析的基礎上，利用生物技術培育藥用植物新品種、進行藥材精準鑒定、實現藥材野生資源保育等。培育高CBD、低THC 含量的新品種是藥用大麻的育種目標。大麻酚酸（CBGA）在四氫大麻酸合成酶（THCAS）和大麻二酚酸合成酶（CBDAS）的催化下分別生成四氫大麻酸（THCA）和大麻二酚酸（CBDA），催化CBGA 形成的芳香族戊烯基轉移酶（AP）、以及THCAS 和CBDAS是決定CBD 含量的關鍵酶。Laverty 等[125]對大麻的全基因組測序結果進行分析，發現AP 與一個已知的總大麻素含量的標記緊密連鎖，其他大麻素生物合成途徑基因沒有連鎖，進一步分析發現，THCAS 和CBDAS 在大麻基因組上位于反轉錄轉座子豐富的區域，這些區域在藥用大麻和工業大麻的等位基因之間高度不同源。杏仁中苦杏仁苷的有無是一個重要的育種目標，Sánchez-Pérez 等[92]在杏仁（Prunus dulcis）基因組研究的基礎上，構建F1 代杏仁苦味分離群體，利用圖位克隆方法，鑒定到一個46 kb 長的基因簇序列區域，該區域存在5 個編碼bHLH轉錄因子的基因，功能鑒定顯示bHLH2 能夠控制PdCYP79D16 和PdCYP71AN24的轉錄，而這兩個基因參與了苦杏仁苷的生物合成通路，bHLH2 蛋白的二聚化結構域中一個非同義替換（亮氨酸替換為苯丙氨酸）可導致這兩個基因的轉錄降低，導致杏仁苦味消失。有關青蒿素生物合成轉錄調控機制研究發現，響應茉莉酸信號的轉錄激活復合體可通過激活青蒿素合成關鍵酶基因雙鍵還原酶2 和醛脫氫酶1 的表達，從而正向調控青蒿素的生物合成[126]。這些研究結果不僅深入解析了植物中次生代謝物多樣性的內在原因，更為藥用植物新品種培育提供了一個綠色通道。在藥用植物多組學研究基礎上，藥用植物育種、快速鑒定以及藥材道地性等方面均取得較大突破，開發出中草藥DNA 條形碼高通量基因測序一體機，可精準、快速、簡易、穩定鑒定中草藥樣品。一批藥用植物新品種獲得新品種證書或國家新品種權證書，湖北中醫藥大學部與其合作者將電化學傳感器與DNA 條形碼技術結合，研制出一種電化學草本傳感器，實現了快速、準確鑒別西紅花及其混偽品[127]，2020 年，西安交通大學部及其合作者采用群體基因組學的分析方法研究大黃（Rheum palmatumcomplex）的異域分化和種內多樣化形成機制，發現掌葉大黃起源于橫斷山區中部或秦巴山區，該類群的異域分化和種內多樣化主要受第四紀冰期避難所和大陸西部地區的天空島嶼的影響，該研究結果為其他藥用植物的種內多樣性研究和同類型藥材的道地性形成機制研究提供了重要的參考價值[128]。

03

藥物毒理學研究

3.1 建立基于網路藥理學探索中醫藥治療復雜性疾病機理的新方法

“網路藥理學”（network pharmacology）即采用系統生物學、藥物化學、藥理學等多學科理論結合高通量多組學、生物資訊學和網路分析技術，構建“疾病-基因-藥物-靶點”之間的生物網路模型，發現藥物對疾病網路的干預和影響，預測其防治疾病的藥效活性成分、作用靶點及分子機制（圖5），李梢團隊采用drugCIPHER 算法預測了47 種常用扶正中藥所含1 446 種成分的靶標譜，采用基因表達高通量檢測技術HTS2 并檢測了其中166 種中藥成分干預420 個腫瘤或免疫相關基因的表達譜，同時分析了133 種中藥成分的公共活性數據，從而綜合繪制了扶正中藥成分調節腫瘤和免疫相關生物網路的分子圖譜。

研究發現，扶正中藥成分的靶標顯著富集在自然殺傷細胞、抗原提呈等免疫相關通路，人參、黃芪和六味地黃丸所含成分能夠顯著上調自然殺傷細胞、T 細胞等通路的基因表達，且部分扶正中藥成分能抑制細胞周期、凋亡等腫瘤信號通路的基因表達，提示扶正中藥在腫瘤預防、腫瘤免疫調節方面具有進一步研發的重要價值[129]。該研究團隊還提出整合計算預測和實驗分析結合的生物分子網路研究方法，以網路為靶標發現多靶點藥物，為中藥多成分的協同效應研究提供了新途徑。研究首先通過基于網路的全基因組致病基因預測方法CIPHER 進行炎、癌相關基因預測，結合疾病的公共基因表達譜資料庫，篩選消化系統炎癌轉化的候選基因集，構建炎癌轉化關鍵分子網路；再應用TGFβ1 誘導的腸上皮細胞惡性轉化細胞模型和CRISPR-Cas9 組合干預策略，識別炎癌轉化關鍵分子網路中的差異遺傳相互作用網路模塊，發現免疫-增殖和代謝-增殖協同模塊可作為炎癌轉化的早期生物標志物；最后研究者篩選六味地黃丸及其類方中具有調節代謝-免疫等協同作用模塊、抑制腸炎細胞惡性轉化的中藥活性成分，為揭示中藥多成分協同作用治療腫瘤等復雜疾病的精準防治探索了一條新途徑[130]，

3.2 藥代動力學新技術和新理論推動中醫藥現代化研究

藥物代謝酶（drug metabolizing enzymes DMEs）的探針底物已成為新藥發現、藥物相互作用評價、精準醫學領域中個性化診療研究中的工具分子。近年來，針對人體重要的DMEs，楊凌、葛廣波研究團隊先后設計研發了多種特異性強、靈敏度高且可用于復雜生物體系（如細胞和組織制備物）中目標酶活性實時檢測的實用方法。2015 年，該團隊基于CYP1A2 催化活性空腔富含蘇氨酸（如Thr-118及Thr-124）這一特征，在1,8-萘酰亞胺熒光母核上有意引入了氫鍵供體使之與蘇氨酸形成強氫鍵作用，進而研發出可被肝臟CYP1A2 特異性識別和催化的底物NCMN，實現了肝細胞及肝組織等復雜生物體系中CYP1A2 活性的高效檢測及超分辨熒光成像[131]。之后，該團隊還利用CYP1A1 催化空腔的體積較CYP1A2更大（524 Å3 VS 375 Å3）這一結構特征，采用酶催化位點局部改造（調整O-烷基的體積）的結構修飾策略，借助計算機輔助設計技術對系列1,8-萘酰亞胺衍生物進行了虛擬篩選和優化，成功研發了首個CYP1A1 亞型特異性的雙光子熒光探針NBCeN，實現了活細胞及活組織等復雜生物體系中CYP1A1 活性的熒光檢測和成像分析[132]。該團隊還基于UGT1A1 的底物偏好性和活性空腔多堿性氨基酸等特征，通過對4-羥基萘酰亞胺類衍生物-UGT 代謝行為的系統研究揭示了4-羥基萘酰亞胺類衍生物的結構-UGT 酶催化選擇性規律，進而設計研發了首個UGT1A1 的比率型熒光探針底物NCHN[133]。該探針被成功應用于生物樣本中UGT1A1 活性檢測、體外快速篩選UGT1A1 酶的抑制劑，標志著UGT1A1-小分子藥物相互作用研究進入了高通量時代，后續，該團隊發現UGT1A1 具有多個配體結合位點，而NCHN 與膽紅素的結合位點不同，因此其無法完全替代膽紅素用于UGT1A1-配體相互作用等研究。為此，該團隊基于UGT1A1 的底物偏好性和光誘導電子轉移原理，設計研發新的可替代UGT1A1 生理底物膽紅素的高特異性和高親和力的熒光探針底物NHPN，其檢測下限可達0.48 μg·mL-1，是目前報道檢測膽紅素代謝酶UGT1A1 活性的最靈敏的方法[134]。該探針底物為UGT1A1 酶的誘導劑和激活劑的高效發現、UGT1A1-配體相互作用機制研究等提供了實用的工具分子和高通量篩選方法，此外，該團隊近年來還先后設計了羧酸酯酶1、羧酸酯酶2、二肽基肽酶-IV（DDP-IV）等絲氨酸水解酶的高特異性熒光探針底物，實現了復雜生物體系（如活細胞及組織等）中目標酶活性的超靈敏實時檢測，源于天然的目標酶調控劑的高通量篩選和配體-靶酶相互作用的高效表征[135-141]，

借助上述光學底物，該團隊采用規模化篩選及譜效結合導向下的抑制劑發現策略，從天然產物及中藥提取物中發現了30 余種藥物代謝酶的強效或特異的抑制劑，以及抑制劑活性篩選的體外評價方法，例如，該團隊發現補骨脂提取物及其多種化學成分可強效抑制膽紅素代謝酶UGT1A1，進而揭示了補骨脂引發高膽紅素血癥及肝損傷的潛在機制與物質基礎[142]，此外，該團隊還發現桑白皮、黃芩及甘草的化學成分可強效抑制腸道羧酸酯酶2 和腸道菌β-葡萄糖醛酸水解酶，揭示了上述中藥減緩伊立替康水解產物SN38 的腸道蓄積、進而緩解其腸道毒性的藥代學機制[143]，

藥代動力學對創新藥物研發和臨床應用具有重要作用。針對經典藥代動力學研究在成藥性評價中常出現藥動/藥效（PK/PD）不相關的問題，大陸學者提出了靶細胞PK/PD 結合研究的新方法，將藥代動力學研究從宏觀的血漿藥物濃度拓展至細胞/亞細胞內藥物濃度的經時過程，提高精準轉化，利于創新藥物研究，王廣基團隊建立MCF-7 多細胞腫瘤球體為單元的PK/PD 模型，采用阿霉素為模型藥物，以引發腫瘤細胞多藥耐藥的關鍵靶點P-glycoprotein (P-gp)為切入點，發現人參皂苷Rh2 預處理停藥后能夠激活磷酸戊糖途徑改善腫瘤細胞內氧化還原紊亂，輕微下調P-gp 表達，促進阿霉素對卵巢癌球體的生長抑制及在其中的蓄積率，由此研究者提出了人參皂苷Rh2-阿霉素序貫治療方案并在在體研究中顯示較強的抗腫瘤作用[144]，同時針對天然藥物、中藥及復方具有豐富的臨床數據資訊和多成分的復雜體系，但卻難以完整解析其物質基礎和作用靶點機制的困境，郝海平提出了“反向藥代動力學”理念，首先明確藥物的ADME 和PK/PD 特性，這些資訊有助于提示藥物的不同成分對于組織/器官/系統/受體的潛在靶向性，進而選擇與作用靶點相關的模型用于藥物活性篩選、靶點識別和作用機制研究，研究團隊應用細胞藥代動力學方法發現，中藥白頭翁的主要活性成分五環三萜類化合物23-羥基白樺酸（23-HBA）能夠顯著降低阿霉素代謝產物阿霉素醇進入心肌細胞線粒體及細胞核的速率和程度。通過在體和離體實驗確證23-HBA 減輕阿霉素誘導的小鼠心臟毒性并抑制了阿霉素的代謝，減少了阿霉素醇在心臟選擇性的蓄積，其作用機制可能是23-HBA 抑制阿霉素代謝催化反應的羰基還原酶1 活性，減少阿霉素醇在心肌細胞線粒體和細胞核的含量從而抗心臟毒性，研究從組織到亞細胞水平闡明了23-HBA 通過影響阿霉素代謝和藥代動力學特性，發揮心臟保護作用的機制，為使用反向藥代動力學理論闡明靶標未知的藥物，特別是從中藥中分離出的活性成分的機理提供了新的研究策略[145]。

代謝組學利用現代分析技術定量測定生物內源性代謝產物變化，結合生物資訊學方法闡明內源性小分子代謝物動態變化規律，獲得關鍵生物標志物，其表征生物體的整體功能狀態的理念契合于中醫藥的整體觀和辨證論治診療思維，王喜軍教授提出了中醫方證代謝組學的研究思路，整合代謝組學和中醫藥理論，對中藥藥效物質、作用機制、方劑配伍規律、中藥質量控制開展研究，特別強調了基于質譜技術的代謝組學有助于闡明中藥在系統藥理學中的復雜性，并增強其在臨床中的價值，成為中醫藥基礎研究的關鍵技術之一[146]，孔令義團隊采用1H NMR譜學技術研究經典名方黃連解毒湯以及4 種變方（即每次從全方中去除一味藥物）對膿毒癥大鼠的治療作用，發現黃連解毒湯全方具有最好的治療效果，代謝組學分析顯示乙酰膽堿、牛磺酸、丙氨酸等20 種代謝產物在黃連解毒湯及其4 種變方之間發生了特異性變化，這種代謝譜特異性的變化與全方、變方不同治療效果有關，這也可能解釋了黃連解毒湯通過活化膽堿能抗炎途徑治療膿毒癥大鼠的生物學基礎，顯示了采用代謝組學方法在闡明中醫藥治療復雜疾病的作用機制方面具有重要的價值[147]，果德安團隊應用液相色譜-高分辨率質譜（LC-HREM）聯用技術根據特征碎片資訊分析中藥中特殊元素成分建立了同位素模式精過濾法（FIPF），從葛根和粉葛中鑒定了9 種硫衍生物，并快速比較了55 種市售樣品含硫衍生物的情況。研究者提出的這種基于分離Mþ2 離子的超高質量分辨率（100000 FWHM@400m/z）篩選硫衍生物的新方法，不僅可以用于中藥材質量優劣的鑒別方法，也是在內源性代謝產物中篩查含硫基藥物或先導化合物的工具[148]，Xbridge Amide 色譜柱（1D）和亞乙基橋雜化(BEH)-C18 色譜柱的離線全二維液相色譜（2D-LC）系統，連接整合混合線性離子阱軌道阱組合質譜和核磁共振分析（LTQ-Orbitrap-MS/NMR）系統，被應用于檢測人參根莖和人參葉中的人參皂苷，結果顯示2D-LC/LTQ-Orbitrap-MS/NMR 系統檢測出646 種人參皂苷，其中427 種為潛在的新代謝產物，顯示出該方法在發現新的天然人參皂苷方面明顯優于傳統植物化學分析方法[60]，

3.3 何首烏肝毒性、馬兜鈴酸毒性為代表的安全性研究推動中藥安全合理使用

肖小河團隊應用藥物基因組學、代謝組學等方法，開展了基于識別何首烏致肝損傷易感人群生物標志物的研究。通過臨床數據的病證毒理學研究證實何首烏僅對少數特定人群具有肝損傷風險，其誘發的特異質肝損傷與機體免疫相關遺傳差異有關，HLA-B*35:01 等位基因是何首烏致肝損傷易感人群的基因標志物，揭示了何首烏肝損傷發生與機體遺傳背景之間的關系[147]，在臨床前瞻性研究中，通過比對何首烏致肝損傷易感個體與耐受個體在攝入何首烏前后的代謝特征，篩選出甘油磷脂代謝、鞘脂代謝、脂肪酸代謝、組氨酸代謝和芳香族氨基酸代謝等25 種主要的差異代謝產物，區分了易感和耐受個體的代謝特征，有助于及早識別藥物肝損傷的易感人群，指導臨床用藥，預防或避免肝損傷重癥化的進展和不良結局的發生[149]。

馬兜鈴酸（aristolochic acids, AAs）致肝癌和生殖癌成為近年來Aas 毒理學研究的熱點，韓澤廣團隊發現馬兜鈴酸I（AAI）單獨使用或AAI 與四氯化碳（CCl4）合用均可誘發小鼠肝癌（肝細胞肝癌、肝內膽管細胞癌），且與CCl4 合用升高小鼠肝癌的發病率。基因組測序數據分析顯示AAI 引起小鼠肝癌中存在典型的DNA 堿基A→T 顛換，導致小鼠Hras 基因（Q61L, CAA→CTA）的激活突變，是引起細胞惡性轉化的關鍵。采用質譜方法隨機檢測62 例人肝癌樣本，發現16例樣本中存在AAI-DNA 加合物，且能夠影響TP53、JAK1 等多個重要基因突變。上述研究提示AAI 致肝癌的機制可能是AAI-DNA 加合物導致DNA 損傷，形成的A>T 突變發生在Hras、TP53 等基因誘發小鼠和人類肝癌的發生[150]。熊波團隊發現AAI 能夠破壞豬卵母細胞的核及細胞質成熟，干擾卵母細胞減數分裂進程和受精能力，其機制可能是由于過度氧化應激誘發的DNA 損傷和細胞凋亡。Aas 毒理學的研究，特別是致肝癌的研究，有待于來自大樣本臨床流行病學、基于分子和基因水平揭示靶器官毒性機制等方面的進一步深化，相關研究結果將有助于對Aas 毒性較全面的科學認識[151]，

3.4 青蒿、海藻、蘇木、雷公藤、烏頭湯等方藥的活性物質作用機制研究

屠呦呦獲得諾貝爾獎，促使大陸外掀起青蒿素拓展研究的熱潮，青蒿素及其衍生物在體內和體外均對多種癌癥表現出細胞毒性作用，對于致癌和腫瘤轉移形成也起到了一定的化學預防和治療作用[152,153]，Li 等[154]為了解決青蒿素類藥物生物利用度低的問題，將二氫青蒿素（DHA）與抗癌化療藥馬法蘭合成藥物偶聯物（ARS4）并發現其具有顯著的抗卵巢癌的體外與體內活性，且作用強于母體藥物DHA 和馬法蘭（melphalan）；在體內ARS4 能夠抑制小鼠卵巢癌細胞的局部生長和腹膜內的擴散和轉移，而對正常細胞沒有明顯毒性，另有研究表明，青蒿素衍生物青蒿琥酯（AS）還能夠緩解一些自身免疫性疾病。如AS 對非肥胖型糖尿病小鼠給藥，能夠通過減少小鼠體內自身免疫性T 細胞和增加保護性T細胞以預防I 型糖尿病的發生[155]。

耿美玉團隊報道了從海藻中提取的寡糖類分子，在褐藻寡糖的基礎上化學修飾得到的甘露寡糖二酸（GV-971），能夠重塑腸道菌群，調節苯丙氨酸/異亮氨酸代謝通路，抑制中樞神經炎癥從而改善阿爾茨海默癥小鼠認知功能障礙，臨床試驗同樣發現GV-971 能夠抑制腸道菌群失調和苯丙氨酸/異亮氨酸含量，減輕神經炎癥而逆轉輕度認知障礙阿爾茨海默癥患者的認知障礙[156]。

屠鵬飛團隊將中藥蘇木的活性成分蘇木酮A（sappanone A，SA）改造為化學探針，利用反向藥物尋靶策略“鉤釣”藥物靶點，針對靶點闡明SA 抗神經炎癥的作用機制，研究發現活血化瘀中藥蘇木治療缺血性腦中風SA 療效確切，但其分子靶點和藥理機制尚不清楚。SA 是蘇木中主要的抗炎活性成分，能夠直接作用于小膠質細胞肌苷-5′-單磷酸脫氫酶2（IMPDH2）cys-140 位點，誘導其變構失活，抑制靶點蛋白下游的炎癥信號通路的活化，發揮抗神經炎癥的作用，研究不僅闡明了SA 的作用，同時發現了潛在的抗神經炎癥的作用新靶點，有助于后續基于IMPDH2 抗炎藥物的設計與研發[157]。

雷公藤中主要活性成分之一雷公藤甲素（triptolide， TP）具有明確的抗腫瘤作用，近年來改善溶解度和生物利用度，減少不良反應，增強聯合用藥的敏感性、抗多藥耐藥等成為其抗腫瘤研究的焦點，譚蔚泓和王學強團隊將TP 與氨基酸修飾的核仁素特異性核酸適體AS1411 偶聯，AS1411 改變了TP 的內化途徑，能夠將TP 選擇性遞送至三陰乳腺癌MDA-MB-231 細胞，原位釋放的TP 誘發溶酶體介導的細胞凋亡發揮作用，在MBA-MD-231 乳腺癌細胞株異種移植小鼠模型中，AS1411 能夠改善TP 的溶解性及對癌細胞的選擇性，AS1411-TP 偶聯物能夠明顯抑制腫瘤生長且無明顯的體內毒性[29]。陳鈞和高小玲團隊針對胰腺導管腺癌（PDAC）因伴有豐富的間質纖維而加劇腫瘤生長及易產生耐藥性等問題，分別設計了表面修飾靶向腫瘤相關成纖維細胞的五肽CREKA 的負載α-倒捻子素（α-mangostin，α-M）的生物可降解聚合物納米粒[CRE-NP(α-M)]，靶向腫瘤細胞NRP-1 受體的CRPPR 肽修飾負載TP 的低pH 響應DSPE-PEG 膠束[CRP-MC(Trip)]。CRE-NP(α-M)能夠抑制腫瘤相關成纖維細胞的活化，減少細胞外基質產生，調節腫瘤微環境。CRP-MC(Trip)在CRE-NP(α-M)預處理后順序給藥能夠明顯抑制原位種植腫瘤的生長，這種連續靶向遞送藥物系統以及順序給藥方案為克服PDAC 的間質屏障，提高化療效果提供了一種有效的途徑[158]。林娜等團隊通過冷凍干燥法制備了一種性質優良的肝癌靶向新型TP-半乳糖-殼聚糖納米制劑，有效減緩TP 的釋放速度，延長藥物療效。由于該納米粒表面具有半乳糖基，能夠與肝實質細胞表面的去唾液酸蛋白特異性結合，因而大大加強了TP-半乳糖-殼聚糖納米粒的肝靶向給藥能力，并顯著降低TP 的生殖毒性和肝腎毒性。通過整合多組學及實驗驗證方法，研究者進一步揭示了TP 及TP-半乳糖-殼聚糖納米粒通過抑制TNF/NF-Κb/BCL2 信號通路，誘導肝癌細胞凋亡，最終矯正失衡網路的抗肝癌作用機制[159]，許國旺和楊春章團隊發現在異檸檬酸脫氫酶1（IDH1）突變膠質瘤細胞中，TP 作為Nrf2 抑制劑，能夠通過下調谷胱甘肽（GSH）合成代謝相關基因GCLC、GCLM 和SLC7A11 表達而破壞GSH 產生，導致細胞內氧化損傷加劇從而介導細胞凋亡，發揮抗腫瘤作用，在低級別膠質瘤和繼發性膠質母細胞瘤病例中，大約70%患者存在IDH1 突變，IDH1 突變引起細胞代謝系統改變，TP 針對GSH 代謝途徑進行干預可能是IDH1 突變型膠質瘤治療的新策略[160]。華子春團隊發現TP 能夠通過減少黑素瘤中浸潤的嗜中性粒細胞數量，下調VEGF 表達而抑制腫瘤血管生成，改善遺傳改造的鼠傷寒沙門氏菌菌株VNP20009 的腫瘤定植作用，促進腫瘤細胞死亡，抑制腫瘤生長。TP通過調節血管生成和宿主免疫反應來增強減毒沙門氏菌抗腫瘤作用，為沙門氏菌介導的腫瘤治療提供了新給藥策略[161]，除抗腫瘤作用外，TP 還能夠通過調節神經免疫炎癥反應在神經退行性疾病和慢性疼痛伴抑郁病癥中發揮神經保護和抗抑郁作用[162,163]。

雷公藤中另外一種主要活性成分雷公藤紅素（celastrol）被認為是治療肥胖的候選藥物。張曉坤團隊發現celastrol 能夠有效抑制喂食60 kcal%高脂飼料的肥胖小鼠體重增加，其作用機制是celastrol 結合于細胞核中的孤兒核受體Nur77，促進其從細胞核轉移至線粒體，與腫瘤壞死因子受體相關因子2（TRAF2）相互作用，即通過TRAF2 的LxxLL 基序介導抑制TRAF2 泛素化，誘發Nur77 Lys63連接的泛素化。泛素化的Nur77 在線粒體上與P62/SQSTM1 泛素結合領域相互作用增強線粒體自嗜敏感性，促進受損線粒體被選擇性清除，從而抑制炎癥和肥胖[164]，

房靜遠團隊組織的多中心隨機雙盲安慰劑對照研究發現黃連提取物小檗堿（berberine，BBR）具有預防結直腸癌的癌前病變直腸腺瘤的復發，研究納入891例近期診斷腺瘤并進行腺瘤全切除手術的患者，在2 年的隨訪期中，小檗堿治療組和安慰劑組分別有155 例（36%）和216 例（47%）患者出現復發性腺瘤，相對危險度0.77（95% Cl 0.66～0.91；P= 0.001），兩組患者在隨訪腸鏡檢測中發現息肉養病變（包括腺瘤和鋸齒狀病變）的分別為小檗堿治療組183 例（43%）和安慰劑組255 例（55%），相對危險度0.77（95% Cl 0.67～0.89；P= 0.002），復發為高危的進展性腺瘤患者分別是小檗堿治療組15 例（3%）和安慰劑組26 例（6%），優勢比0.52（95% Cl 0.26～0.99；P=0.05），在2 年隨訪過程中未發現結直腸腺癌，無不良反應報告[165]，蔣建東等團隊設計了負載小檗堿BBR 的疏水α-生育酚內核和聚乙烯乙二醇-硫醇外殼的膠束（CTA-Mic），BBR-CTA-Mic 能夠有效地促進肝臟沉積和BBR 的肝細胞攝取，改善高脂飲食喂養小鼠代謝譜，上調小鼠肝臟中LDLR、p-AMPK 和InsR 等基因和蛋白表達，降低血脂和血糖，抑制炎癥因子，實現BBR 在肝臟的有效積累促進其發揮抗動脈粥樣硬化及調節代謝的作用，并為天然藥物的靶向治療提供了新的方法[166]。

林娜團隊采用“病（證）標志-藥物靶標”關聯網路全局解析策略，闡釋寒痹經方烏頭湯“寒者熱之”的中醫治療原理并發現塔拉定和芍藥苷是該方緩解寒痹的代表性藥效物質。按照“病證分子辨識-藥物靶標預測-核心網路靶標篩選-關鍵藥效物質鑒定-關鍵分子機制驗證”的研究路徑，對比研究烏頭湯候選靶標對寒、熱病證分子網路的干預特點，并發現其通過調節產熱/能量代謝和炎癥/免疫相關的信號分子；進一步，通過分子對接虛擬計算和表面等離子共振檢測，從該方具有良好成藥性的潛在活性化合物群中篩選出塔拉定和芍藥苷是與上述核心靶蛋白結合的最佳候選化合物，并通過系列“藥動-藥效、體內-體外、正向-反向”實驗得以驗證[167]，由于烏頭湯被譽為“痛痹要方”，該團隊又針對這一方劑的鎮痛主效應，應用生物分子網路研究發現方劑所含主要活性成分芍藥苷與甘草苷可能是一種有開發前景的止痛藥物組合，研究首先采用HPLC/ESI-LTQ-Qrbitrap-MS 鑒定了烏頭湯水提物中的77 種化合物，再通過ADME in silico 預測其中具有良好成藥性潛能的候選活性成分群及候選靶標譜，構建了化合物成分-神經病理性疼痛相關基因-靶點多維網路，整合網路計算、分子對接和表面等離子共振檢測，最后通過藥代動力學和在體/離體實驗驗證，確定了芍藥苷和甘草苷是烏頭湯緩解神經病理性疼痛的主要藥效活性成分，其作用機制與負向調節CCL5-CCR5-GNAI1-SRC-PIK3CA-AKT 趨化因子信號軸有關[168]，

孔令義和周湘團隊發現甘草的天然產物甘草次酸（glycyrrhetinic acid, GA）是新型的線粒體靶向配體，能夠改善線粒體通透性，提高線粒體藥物吸收，研究者設計了負載阿霉素的GA 功能化的氧化石墨烯（GO）給藥載體（GA-GO），與非GA 功能化的納米載體遞送系統相比，GA-GO@DOX 能夠明顯降低線粒體膜電位，破壞Bax/Bcl-2 平衡，導致細胞色素c 從線粒體膜釋放并激活線粒體介導的細胞凋亡，發揮抗腫瘤作用。值得注意的是，GA-GO 在表現出其更好的誘導細胞凋亡和抗癌效果的同時，也顯示其低毒特性，是一種有效的靶向線粒體的藥物遞送系統[169]。

04

藥物制劑研究

4.1 仿生紫杉醇藥物載體等納米技術推動天然藥物新劑型的蓬勃發展

4.1.1 以仿生紫杉醇納米傳輸載體為代表的腫瘤靶向給藥體系取得重要進展

仿生藥物傳輸體系模擬生物體系中的粒子如細胞、囊泡、病毒等，為提高藥物轉運體系的生物相容性和療效提供了極為廣闊的空間[170]，其具有可延長血液循環時間、降低免疫原性和可實現主動靶向等優點，近5 年來，研究人員在仿生納米藥物研究領域取得眾多突破性成果。2015 年張良方等[171]采用血小板細胞膜分別包被載多西紫杉醇和萬古霉素的聚（乳酸-乙醇酸）（PLGA）納米粒，分別用于大鼠動脈再狹窄和小鼠血液感染模型的靶向治療，取得顯著的治療效果。李亞平和王思玲等[172]將紫杉醇納米粒用小鼠乳腺腫瘤4T1 的細胞膜包敷，獲得的仿生納米藥物具有對小鼠轉移性乳腺腫瘤4T1 的高度靶向能力，可降低巨噬細胞對納米藥物的吞噬，并可顯著減少腫瘤的肺轉移能力，相較于非仿生納米紫杉醇，仿生納米紫杉醇使乳腺腫瘤的肺轉移結節數量減少6.5 倍。張燦團隊將紫杉醇脂質體導入中性粒細胞，利用中性粒細胞可穿過血腦屏障的性能及在術后產生的炎癥因子風暴IL-8 和CXCL1/KC 作用下響應性釋放出紫杉醇，該團隊將該紫杉醇脂質體用于治療小鼠復發性神經膠質瘤，可顯著延長小鼠的生存時間[173]，最近，郭培宣團隊利用具有超級熱力學穩定性的RNA 四向連接（4WJ）納米顆粒，將紫杉醇溶解度提高了32 000 倍。他們在RNA 納米顆粒上引入靶向乳腺癌的表皮生長因子受體（EGFR）核酸適配體，可顯著增加細胞對RNA-紫杉醇納米顆粒的內吞，且能明顯抑制MDA-MB-231 乳腺癌小鼠移植瘤的生長[174]，

相對于常規制劑，盡管納米藥物制劑在動物模型上往往體現出顯著的治療效果，但其在臨床上的表現有時并不盡如人意，例如Shitara 等[175]于日本針對741名晚期胃癌患者開展了III 期臨床研究，該團隊以常規紫杉醇制劑作為對照，采用白蛋白結合紫杉醇納米粒治療此前對一線化療不敏感的患者，發現納米紫杉醇治療組患者的中位生存期僅稍好于常規紫杉醇制劑組，Untch 等[176]在德國針對1206 例患有早期乳腺癌患者的治療研究也表明，盡管白蛋白結合紫杉醇納米粒在抑制腫瘤轉移方面的表現明顯好于常規紫杉醇制劑，但兩個治療組中患者的長期生存率并無顯著性差異，提示由于動物模型常常不能真實反映人體的病理生理過程，將納米藥物從動物水平的模擬推廣/轉化到人體臨床應用的過程仍有相當長的距離，同時也引起人們納米藥物腫瘤靶向性的機理產生了質疑，

眾所周知，為從血液中快速獲取氧氣和營養物質以滿足腫瘤細胞不斷增殖的需要，腫瘤新生血管具有很高的滲透性，納米藥物能聚集到腫瘤是因為其能穿過腫瘤血管內皮細胞之間的間隙（內皮間隙，尺寸從幾十到2 000 nm），并因腫瘤組織的淋巴循環缺損而被滯留下來，即腫瘤的高通透滯留（enhanced permeabilityand retention, EPR）效應，EPR 效應，以及納米藥物制備技術、形狀大小及表面性質調控方法的發展，在過去30 年推動了納米醫學尤其是在癌癥領域的發展，近期，加拿大多倫多大學部Chan 等[177]用電鏡對多種腫瘤的300 多條血管的觀察分析，顛覆了學界對EPR 效應的認知，并通過ICP-MS、TEM 和三維成像在活體和Zombie 模型中系統研究，發現內皮間隙并不是納米顆粒進入實體腫瘤的原因，取而代之的是，絕大多數納米顆粒是通過內皮細胞的主動轉胞吞過程進入腫瘤。由于結論顛覆了以往認知，該文一經發表便受到研究者廣泛關注， NatureMaterials 刊登了關于該文的社論、新聞與觀點、評論等三篇文章，呼吁進一步探究腫瘤治療的挑戰與未來，對納米藥物主動轉胞吞深入腫瘤的了解將開啟增強腫瘤積聚的策略，有助于我們制定策略來克服癌癥納米藥物臨床轉化的不足，

4.1.2 以CRLX101 為代表的喜樹堿新型納米藥物

喜樹堿（camptothecin）是在生長于大陸華南的尖葉喜樹（Camptotheca acuminata）中發現的強效抗腫瘤藥物，其水溶性衍生物伊立替康和拓撲替康已被FDA 批準用于結腸癌和卵巢癌的治療。針對喜樹堿及其衍生物新劑型的研究一直是制藥公司和研究人員關注的重點。美國加州理工學院Mark E. Davis 團隊開發的CRLX101 是一種喜樹堿/聚乙二醇-環糊精（PEG-CD）納米藥物，目前處于II 期臨床研究。Davis 等[178]通過內窺鏡技術及免疫組化分析了該納米藥物在9 名胃癌患者中的藥代動力學情況，發現該納米藥物可在患者腫瘤組織中蓄積，而腫瘤附近的非腫瘤組織未觀察到納米藥物，顯示出該納米藥物對實體腫瘤良好的靶向作用。另外，經過治療后患者體內的腫瘤標志物碳酸酐酶IX 和拓撲異構酶I 表達顯著降低。

結直腸腫瘤是最常見的腫瘤類型之一，研究表明，腸道菌群中的某些特定細菌在結直腸腫瘤的進展與治療中均起至關重要的作用。如核梭桿菌（Fusobacterium nucleatum）會促使腫瘤細胞發生保護性自噬，導致腫瘤細胞產生對化療藥物的耐受性。張先正報道了一種基于噬菌體介導的靶向性納米伊立替康，成功用于調控小鼠腸道菌群并有效提升了腫瘤化療效果[179]，戴志飛等[180]將喜樹堿與氟脲苷通過季戊四醇共價連接并與二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺DSPE-聚乙二醇2000 制備載藥納米囊，該納米囊可顯著延長藥物在動物體內的循環時間，對小鼠PC-3 前列腺癌移植瘤顯示出優良的協同治療效果，陳曉遠等[181]采用喜樹堿前體藥物和納米氧化鐵等制備了pH 和H2O2 雙重響應的納米藥物，用于對小鼠肺癌模型的化學/化學動力聯合治療。郭培宣等[182]采用低聚RNA 與喜樹堿共價連接制備的納米粒對小鼠鼻咽癌模型顯示出顯著增強的治療效果。廖永紅等[183]設計制備了尺寸可變的葉酸修飾多肽/透明質酸納米膠束，可延長血液循環時間并促進在腫瘤細胞內的攝取，采用該載體共裝載7-乙基-10-羥基喜樹堿（SN38）和近紅外熒光探針吲哚菁綠，并用于對小鼠黑素瘤的診斷治療。結果顯示，經化療/光動力聯合治療的荷瘤小鼠，有50%的小鼠腫瘤完全消失，張川等[184]采用DNA 修飾喜樹堿以增加藥物的水溶性，得到的前體藥物可自組裝形成四面體結構。相對于游離藥物，該納米喜樹堿對裸鼠移植結腸腫瘤具有顯著增強的藥效作用，申有青團隊研究了不同大小的納米藥物在動物體內的動力學，他們合成了粒徑可調控的7-乙基-10-羥基喜樹堿聚合物前體藥物，發現隨納米藥物的粒徑增大，其血液循環時間及在腫瘤中的攝取都增加，較理想的粒徑范圍為100~160 nm，然而，更高的腫瘤攝取并不意味著抑瘤效果的提高，原因是相對于較小的納米粒子（30 nm），較大的納米粒子（100 nm）對腫瘤的穿透能力減弱[185]，這與Kataoka 等[186] 的研究結果一致，表明為提高對腫瘤的治療效果，納米藥物的研發需要在腫瘤的蓄積能力與對腫瘤的穿透能力之間尋求平衡。針對大尺寸納米藥物在致密腫瘤內依靠自身擴散被動滲透難的瓶頸問題，申有青等和加州大學部洛杉磯分校顧臻團隊合作，利用腫瘤血管內皮細胞上及血管附近腫瘤細胞高表達γ-谷氨酰轉肽酶（GGT）的特點，設計合成了GGT 響應的聚合物PBEAGA 及其與化療藥物喜樹堿（CPT）的偶聯物PBEAGA-CPT，其可自組裝成納米顆粒[187]。該納米喜樹堿到達腫瘤毛細血管后，內皮細胞表面的GGT使納米粒表面聚合物上的γ-谷氨酰基水解而產生胺基，使納米粒帶正電荷，觸發血管內皮細胞快速轉胞吞滲入腫瘤，進而借助轉胞吞作用在腫瘤組織內跨細胞傳遞。尾靜脈注射10 min 后，納米藥物就已經外滲出血管并遍布整個腫瘤區域，1h 內腫瘤組織內藥物濃度和血管內基本相當。該納米粒尾靜脈注射不僅能完全治愈起始體積為100 mm3 的小腫瘤，也能使已處于指數增長、難治的大腫瘤（500mm3）迅速縮小，停藥未見明顯反彈，抑瘤率高達98%，這種化被動滲透為主動滲透的策略促進納米藥物在腫瘤組織內的蓄積，為下一階段納米藥物的設計開辟了新的思路，針對晚期結直腸癌，鹽酸伊立替康是臨床廣泛使用的廣譜細胞毒性藥物。但是，其存在致死性腹瀉脫水、腹部痙攣性疼痛、發熱等不良反應，梁興杰課題組利用相容性好的生物材料實現了鹽酸伊立替康納米化，于2019 年獲準開展臨床試驗。這是目前大陸獲得批準進入臨床的第一個名稱中含有“納米”字樣的治療性新藥。2020 年4 月，國家納米中心與廣東惟楚醫療科技有限公司簽署合作協議，接續抗腫瘤2.2 類新藥注射用鹽酸伊立替康（納米）膠束臨床試驗研究，該成果轉讓金額超過億元，

4.1.3 以小檗堿等納米藥物為代表的中藥活性成分新劑型

生物堿是含氮化合物，多具有復雜環狀結構，為中藥與天然植物的重要有效成分之一。小檗堿（berberine）是廣譜抗菌藥物，臨床上鹽酸小檗堿用于治療胃腸道感染。小檗堿廣泛存在于黃連（Coptis chinensis Franch.）、黃柏（Phellodendron chinense Schneid.）等中藥中，然而，其注射劑可引起心臟抑制及阿斯綜合癥等，嚴重時可導致死亡，大陸已淘汰鹽酸小檗堿注射劑，納米技術的發展為小檗堿的減毒增效提供了有效途徑，雷海民等發現小檗堿與黃芩苷在特定條件下可形成納米粒子，與小檗堿相比，該納米復合物具有顯著增強的抗菌及清除生物膜的能力，該研究為中藥復方相對于單方的協同起效作用機制的探討提供了一種可能解釋[188]。

雷公藤甲素（triptolide）是環氧二萜內酯化合物，為衛矛科植物雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook. f.）的主要活性成分之一，具有抗炎、免疫抑制、抗類風濕、抗腫瘤等藥理作用。臨床上有雷公藤片、雷公藤多苷片等，因其水難溶性而應用受到限制。Kong 等[189]將雷公藤甲素載入pH 超敏感膠束并實現腫瘤細胞靶向，通過阻斷腫瘤細胞溶酶體的酸化作用和快速釋藥實現對小鼠胰腺腫瘤的有效治療。Feng 等[158]針對胰腺導管癌成纖維結締組織增生的特點，設計了可靶向腫瘤相關成纖維組織的納米粒子并共裝載α-倒捻子素和雷公藤甲素，該納米藥物可顯著增強藥物的抗腫瘤藥效并能明顯減少腫瘤細胞外基質的生長，

黃酮類化合物也是廣泛存在于中藥與天然植物中的活性物質。槲皮素（quercetin）廣泛存在于許多植物的莖皮、花、葉、芽、種子、果實中，多以苷的形式存在，如蘆丁、槲皮苷、金絲桃苷等。槲皮素具有抗炎、降血壓、抗病毒、抗腫瘤等藥理活性，美國北卡羅來納大學部黃立夫等制備了粒徑為35 nm 的槲皮素納米粒，可顯著提高槲皮素的生物利用度及代謝穩定性，該納米槲皮素可通過顯著下調Wnt16 的表達，改善胰腺癌的腫瘤微環境，通過抑制腫瘤周圍組織的纖維化從而提高納米順鉑用于富含成纖維組織的膀胱癌模型的協同治療作用[190]，

天然多酚類化合物是一類重要的具藥理活性化學物質，廣泛存在于中藥與天然植物之中，姜黃素（curcumin）是姜科、天南星科等植物根莖中的一種多酚化合物，作為天然色素廣泛應用于食品工業、中藥及印度藥中，姜黃素具有抗氧化、抗老年癡呆、抗腫瘤等活性，但因其溶解度不高而導致其生物利用度較低，且穩定性差、代謝快，影響了其在制藥領域的應用，

為提高姜黃素的口服生物利用度，Sung 等[191]巧妙采用二乙基三胺戊乙酸二酸酐、碳酸鈉、十二烷基硫酸鈉制備了一種自發泡體系，其可與姜黃素在腸道環境下自發形成納米乳，該納米乳可被動靶向至腸道M 細胞，并通過腸道-淋巴系統被吞噬和轉運至胰腺組織。該納米乳可使急性胰腺炎大鼠模型胰腺中的藥物濃度比游離姜黃素組高12 倍，蔣晨團隊設計了修飾有可靶向晚期糖基化終末產物受體多肽的聚乙二醇-聚賴氨酸兩親膠束并裝載姜黃素，制備的納米藥物可通過仿β-淀粉樣蛋白轉運途徑在阿爾茨海默癥小鼠模型病變組織中蓄積，該聚合物可捕捉活性氧自由基，攜帶的藥物可抑制β-淀粉樣蛋白的表達，通過該納米藥物的協同作用調控小神經膠質細胞，從而緩解β-淀粉樣斑塊造成的負擔，提高阿爾茨海默癥小鼠模型的認知能力[192]。

唇形科植物迷迭香（Rosmarinus officinalis Linn）是一種藥食兩用植物，在西方常用作食用調料，迷迭香酸（rosmarinic acid）是迷迭香中一種水溶性天然多酚類抗氧化劑，也廣泛存在于夏枯草（Prunella vulgaris L.）、紫蘇子（Perillae fructus）等中藥中，具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤等活性，Jon 等[193]采用聚乙二醇（PEG）修飾迷迭香酸，得到直徑約60 nm 的納米粒子，該納米藥物可通過減少結腸炎小鼠模型的氧化應激而對其炎癥進行治療。

4.2 以大麻素類藥物為代表的天然藥物制劑

目前，傳統劑型仍在臨床使用藥物劑型中占據主流地位。除口服制劑外，黏膜給藥制劑等局部給藥制劑由于其應用方便、患者順應性好的優點，因而也得到了各制藥公司的重視。

大麻（C. Sativa L.）又名線麻、寒麻、云麻、火麻等，是桑科（Moraceae）大麻屬（Cannabis L.）一年生草本植物，為大陸傳統經濟作物，廣泛應用于醫藥、食品、保健品、化妝品等領域。大麻素是一類含有21 或22 個碳的羧基化萜酚類特有的化合物，具有廣泛的藥理活性，包括抗癲癇、治療多發性硬化、抗炎、抗抑郁、抗腫瘤等，在臨床上應用于治療癲癇、多發性硬化癥等。英國吉瓦制藥（GWPharma）開發的Setivex®（Nabiximols）是一種含有四氫大麻酚和大麻二酚的口腔黏膜噴霧劑，于2010 年在英國上市，用于多發性硬化患者減輕神經性疼痛、痙攣、膀胱過度活動癥和其他癥狀。該公司基于大麻二酚的液體口服制劑Epidiolex®，2018 年6 月獲美國FDA 批準，用于治療2 歲及以上患者的Dravet綜合征和Lennox-Gasraut 綜合征相關的罕見癲癇發作治療。Riva 等[194]采用Nabiximols 針對60 名患有運動神經元病的患者開展了II 期臨床研究，他們發現，與安慰劑組相比，Nabiximols 組可有效緩解患者的痙攣癥狀，并且該藥物顯示出較好的安全性及患者順應性。Thiele 等[195] 采用Epidiolex® 治療患有Lennox-Gastaut 綜合征的患者，在該III 期臨床試驗中，服用大麻二酚患者的每月癲癇發作頻率降低了43.9%，而安慰劑組僅降低了21.8%，同時，該制劑的不良反應多數較輕微，Devinsky 等[167]另外開展的III 期臨床試驗也得到相似的臨床效果。以上研究充分說明了大麻素類藥物在臨床上的重要潛力，另外，黏膜給藥劑型和液體口服劑型尤其適用于兒童及老年患者，

4.3 以Trodelvy™為代表的抗體偶聯藥物（antibody–drug conjugates, ADC）制劑加快推向臨床

抗體偶聯藥物是將單克隆抗體的高特異性、體內長循環性和小分子細胞毒藥物的高活性相結合，以提高抗腫瘤藥物的靶向性、減少不良反應[196]。與傳統完全或部分人源化抗體或抗體片段相比，ADC 因為能在腫瘤組織內釋放高活性的細胞毒藥物從而理論上療效更高，和融合蛋白相比，它具有更高的耐受性和/或較低的副作用。ADC 藥物對靶點的準確識別性及非癌細胞不受影響性，極大地提高了藥效并減少了不良反應，因而備受關注，第一個被美國FDA 批準的ADC藥物是輝瑞的Mylotarg®，用于治療急性單核細胞白血病，其因不能延長患者的生存期和更高的毒性而被輝瑞終止上市[197]，

羅氏的注射用恩美曲妥珠單抗（Trastuzumab emtansine，商品名赫賽萊（Kadcyla®））是大陸首款獲批上市的ADC 藥物，用于HER2 陽性乳腺癌患者的輔助治療，美登素（maytansine）是衛茅科美登木屬及其親緣植物中的強效抗腫瘤生物堿，恩美曲妥珠單抗中的細胞毒藥物為美登素衍生物。Trodelvy™（Sacituzumab govitecan）是一種新型ADC 藥物，由靶向Trop-2 抗原的人源化IgG1 抗體與化療藥物伊立替康（拓撲異構酶I抑制劑，為水溶性喜樹堿衍生物）的代謝活性產物SN-38 偶聯而成。Trop-2 是一種在90%以上的轉移性三陰性乳腺癌（TNBC）患者中表達的細胞表面糖蛋白。Sacituzumab govitecan 可將藥物以Trop-2 為靶點進行針對性治療，

2020 年4 月22 日，美國FDA 加速批準Trodelvy™用于治療既往已接受至少2 種療法的TNBC患者，這是首款獲得FDA 批準治療轉移性三陰性乳腺癌患者的靶向Trop-2 的抗體偶聯藥物。Bardia 等[198]針對69 例TNBC 患者的治療中，發現該單抗偶聯藥物的響應率達30%。開發ADC 藥物對單克隆抗體的要求是無免疫原性、高效和脫靶率低；而對細胞毒藥物的要求為：半抑制濃度（IC50）在亞納摩爾水平、具有適宜的水溶性、對多藥耐藥蛋白1（MDR1）不易感等[197,199]，目前，全世界有超過100 種ADC 藥物處于不同臨床研究階段[200]。天然藥物的多樣性可為ADC藥物的開發提供更多選擇，

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