《細胞》子刊:這一次,砒霜立大功了!大陸科學家首次發現,砒霜竟可以復活結構性突變的最強抑癌蛋白p53,恢復其抑癌活性丨科學大發現


我怎么也沒想到,古老的砒霜會在21世紀與最強抑癌蛋白p53相遇,而且還成為恢復突變p53抑癌能力的最強“潛力股”,

近日,由上海交通大學部瑞金醫院盧敏和牛津大學部Xin Lu領銜的研究團隊發現,砒霜(三氧化二砷,ATO)中的砷原子竟然能插入發生結構性突變、不能正常折疊的p53蛋白的DNA結合域,幫助突變p53蛋白折疊出有抑癌功能的三級結構[1]。

更重要的是,這項研究成果一舉解決了困擾p53靶向藥物開發的兩大科學難題:無邏輯、無口袋,

換句話說,盧敏等的研究成果證實:一直被認為缺乏邏輯支撐的“通過靶向藥物恢復突變蛋白活性”的思路,在p53蛋白上是可行的一向被認為缺乏靶向藥物結合口袋的p53蛋白,確實隱藏著一個不為人知的砷原子結合口袋

總的來說,這是抑癌蛋白p53靶向治療近40年來取得的重大突破,靶向治療或由此迎來新一輪爆發。基于本研究成果的相關臨床研究(PANDA-T0;NCT03855371),也在瑞金醫院的主持下開展[2],

相關研究成果發表在著名期刊Cancer Cell上,盧敏和Xin Lu是共同通訊作者,陳碩、Wu JiaLe、Liang Ying、Tang YiGang為共同第一作者。


本研究論文截圖

小分子靶向治療藥物的誕生,改寫了很多癌癥的治療范式,

然而,目前已經獲批用于臨床治療的靶向藥物覆蓋的患者并不多。這在一定程度上是受靶向藥物開發策略的影響,

我們都知道,在人體內有原癌基因和抑癌基因。原癌基因突變后,就會編碼癌蛋白,誘發癌癥;而抑癌基因突變,會導致抑癌蛋白失去抑制癌癥形成和發展的能力。因此,從理論上講,消除癌蛋白和恢復抑癌蛋白活性,都能用于癌癥的治療,

不過,事情并沒有那么簡單,

以各種各樣激酶為代表的癌蛋白存在一個與ATP結合的口袋,只要開發相關藥物,能占據或阻止ATP的進入,即可抑制癌蛋白的促癌活性。


而因突變失活的抑癌蛋白,開發藥物的思路則完全是要反其道而行之:恢復抑癌蛋白的活性。這項拯救工作的難度有多大,從臨床獲批的藥物就能看出來。投入臨床使用的癌蛋白靶向藥物已經有100多個了,而抑癌蛋白的靶向藥物這一數據是0。

這背后的主要原因是:第一,恢復蛋白功能從邏輯上講是極難實現的;第二,抑癌蛋白缺少讓小分子藥物結合的口袋,

盡管開發抑癌蛋白靶向藥物難度極大,但還是阻擋不住科學家的熱情。就拿p53這個抑癌蛋白來說,全球約50%的癌癥患者發生突變,這也就意味著,從理論上講,僅p53靶向藥物就可用于治療全球約50%的癌癥患者,而目前已經獲批用于臨床治療的100多個靶向抗癌藥加在一起,也僅能用于2-13%癌癥患者的治療[3,4],


p53突變所占比例

也正是因為這個原因,p53成為迄今為止被研究的最多的蛋白[5]。

科學家們的努力也沒有白費,

現在我們已經知道,由393個氨基酸組成抑癌蛋白p53包括3個功能域:發揮轉錄激活作用的N端功能域;幫助p53定位的C端功能域;以及位于中間的DNA結合域(DBD)[6],

p53的突變類型多樣,有基因片段缺失、插入,點突變引起的錯義突變等。不過,在所有突變類型中,占主導地位的還是點突變引起的錯義突變,占比高達80%[6],更重要的是,97%的點突變發生在DNA結合域[6],

從結構上看,上述點突變對p53 和DNA相互作用影響的機制可以分成兩類[7,8]:其中一些p53突變(如突變熱點Arg248和Arg273處的突變)導致p53不能與DNA接觸;而其余的許多突變則被稱為結構性突變(如熱點Arg175、Gly245、Arg249和Arg282處的突變),這些突變損害了p53的DNA結合域(DBD)結構,導致p53無法正常折疊,不能與DNA緊密結合,因此喪失了抑癌能力


不難看出,p53突變不僅主要分布在DBD區域,而且異質性非常高

實際上,在過去的幾十年里,科學家已經發現了很多有拯救p53突變潛力的先導化合物[9,10],只不過這些化合物恢復p53功能的效率比較低

盡管如此,盧敏和他的同事還是認真研究了這些化合物的特點。他們注意到這些化合物都有一個有趣的特點,即能夠結合半胱氨酸的硫醇基團[9,11]。

基于此,他們進一步假設,當p53的DNA結合域被結構性突變損害時,那些能夠結合多個半胱氨酸的化合物或許可以穩定p53,恢復p53的抑癌活性。他們還推測,通過這種方法,或許能找到拯救p53結構性突變的通用化合物,而這些突變合計占所有p53突變的一半以上。


假想的候選化合物可能的結合位點

有了上述假設之后,盧敏團隊就開始著手篩選能與2個及以上半胱氨酸結合的小分子,最后通過5個具有p53結構性熱點突變的細胞系(R175H等)實驗,從DTP資料庫的20861個小分子[12]中篩選到4個化合物


篩選到的4個化合物結構

通過優先識別折疊p53蛋白的抗體PAb1620檢測,研究人員發現,砒霜和KAsO2對有R175H結構性突變p53蛋白的折疊存在驚人促進作用。簡單地說,就是砒霜能恢復有R175H結構性突變p53蛋白的抑癌活性,而另外兩種化合物的這種活性則要弱的多,

隨后研究人員用另外4個不同的p53結構性突變細胞系檢驗了砒霜的效果,用PAb1620抗體檢測發現,竟達到了野生p53蛋白的水準

劑量研究表明,僅需低至0.1μg/mL的砒霜,就足以促進結構性突變p53蛋白在給藥的15分鐘之后正確折疊

總的來說,研究人員通過多級篩選研究,確定了含砷化合物能有效地重新激活最常見的p53結構性突變體。

隨后的研究發現,砒霜是通過共價結合穩定結構性突變的p53折疊。而且與之前發現的化合物,以及本研究中發現的其他化合物相比,砒霜的穩定作用遠超其他化合物


砒霜與其他化合物的共價結合比較

為了弄清楚砒霜恢復結構性突變p53的機制,盧敏團隊10余位成員又花費近6年時間完成了p53-砷共結晶結構的解析,明確了p53功能復活的機制[13]。總的來看,p53-砷復合物與已公布的p53 DBD結構重疊性良好。

具體來看,砷與DNA結合域的Cys124、Cys135和Cys141相互作用,與此同時,Met133的側鏈朝向砷,并與砷原子之間存在范德華相互作用。正是DNA結合域中的這4個氨基酸殘基,搭建了一個可以與砷原子結合的口袋,


砷原子結合口袋全貌

由于p53本質上是一個轉錄因子,因此檢驗結構性突變p53功能恢復的辦法之一是檢測轉錄的激活狀況。研究結果顯示,砒霜能介導所有攜帶結構性突變p53的測試細胞系轉錄重新激活,而對于影響p53與DNA接觸的突變類型,砒霜則沒有激活的作用

既然如此,砒霜的抗癌效果究竟如何呢?

盧敏團隊隨后在CDX和PDX小鼠模型上探索了砒霜的抗癌效果,砒霜的使用劑量是5mg/kg,這個劑量在小鼠中產生0.05-0.2μg/mL 砷血漿濃度,在砒霜治療的急性早幼粒細胞白血病(APL)患者中可以達到,而且不會產生嚴重的毒性[14,15]。

血液腫瘤的研究顯示,砒霜顯著延長了小鼠的中位生存時間,而實體瘤研究也顯示,小鼠的腫瘤體積僅為對照組的10%左右

以上的研究表明,砒霜確實有強烈的抑癌作用。


血癌(上)和實體瘤(下)的研究結果

而且與一線化療藥物順鉑的比較顯示,砒霜對非小細胞肺癌的抑制作用與順鉑相似,

分析背后的作用機制發現,在砒霜處理的PDX腫瘤中檢測到p21的上調,而在順鉑處理的PDX腫瘤中沒有檢測到,

相比之下,與對照組相比,順鉑處理的腫瘤中DNA損傷標志物表達的增強更為強烈,而砒霜處理的腫瘤中沒有,

這也意味著順鉑和砒霜的抗癌機制并不相同,而且砒霜抗癌的原因至少有部分是因為重新激活了結構性突變的p53蛋白


順鉑(CIS)和砒霜(ATO)的比較

在研究的最后,盧敏團隊成員探討了另一個重要的問題:砒霜的適用范圍究竟有多大。

于是他們挑選了25個最常見的p53突變,它們都位于DNA結合域,且占到了癌癥中p53錯義突變的40.87%,其中18個是結構性突變,另外7個是DNA接觸性突變。


25個突變的分布

總的來看,大部分結構性突變的p53被砒霜拯救,只是程度不盡相同。而DNA接觸性突變p53,則沒有被砒霜拯救

隨后的細胞系研究也證實,砒霜對具有結構性突變p53的癌細胞系顯示出明顯更強的殺傷力


砒霜的不同類型突變細胞系研究

總的來說,盧敏團隊的研究非常有系統性,確定了砒霜恢復結構性突變p53抑癌功能的潛力。這個研究還一舉解決了困擾p53靶向藥物研發的兩大科學難題,證明了靶向抑癌蛋白確有其邏輯,而且也存在小分子化合物結合的口袋。


本研究主要內容總結

由于砒霜已被大陸科學家開發成為治療APL的藥物,因此將其開發成p53突變癌癥的治療藥物有大量的臨床經驗可以借鑒,這無疑會加快其臨床開發速度,好消息是相關的臨床研究已經開展。

更重要的是,這個研究提出了抑癌蛋白靶向治療的思路,或將開啟靶向治療新時代

參考文獻:

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本文作者 | BioTalker

汝之砒霜,彼之蜜糖

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